迪必尔生物工程(上海)有限公司

前言
细胞与基因治疗（CGT）在现代医疗尤其是癌症和遗传病的治疗领域有着极大的发展空间，目前国内外已有多款包括溶瘤病毒药物在内的CGT药物获批上市。
溶瘤病毒（OV）是一类新兴的癌症治疗药物，是目前研究较多的新型基因治疗药物。其中Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）重组病毒载体被广泛用作OV载体^[1]，具有感染谱广、病毒基因组容量大、对人体致病性较弱、可提高抗肿瘤疗效等优点。
本文基于迪必尔生物CloudReady:tm:（500 mL）云平台生物反应器建立单纯疱疹病毒载体HSV-1的制备工艺，验证了高通量微小型生物反应器在单纯疱疹病毒基因治疗应用领域的优势和适配性。

方法与结果
本工艺实验在迪必尔生物“应用技术与工程研究中心（CARE）-病原微生物实验室（BSL-2）”开展，所用病毒载体为中国科学院深圳先进技术研究院提供的Ⅰ型单纯疱疹病毒重组病毒载体HSV-1-GFP。使用迪必尔生物 CloudReady:tm:（500 mL）云平台生物反应器（图1）进行Vero细胞的培养。在初始200 mL工作体积下，Vero细胞接种密度为5×10⁵ cells/mL，微载体浓度为5 g/L。本次实验工艺参数设置如表1所示。温度由半导体Peltier模块的加热和制冷实现无水控温。DO由空气和氧气的通气速率级联控制。pH由二氧化碳的通气速率和碱液（0.5 M NaOH）的流加速率级联控制。其中，进气模式均为底部通气。

表1 反应器工艺参数

图1 CloudReady:tm:生物反应器

为维持罐内营养物质水平并减少代谢物累积，Day2~3以1VVD的灌流速度进行灌流，Day0~3微载体上细胞密度变化如图2所示。为保证病毒载体充分接触并感染Vero细胞，在Day3细胞刚好铺满微载体而尚未达到最高细胞密度时，换液75%并以MOI=0.1接入HSV-1-GFP病毒载体。在Day5接毒48h后补充100 mL新鲜培养基，此后维持工作体积300 mL。Day6~7每天收获50%上清液并补入等量新鲜培养基，Day8收获全部上清液。

图2 Day 0 ~ Day 3微载体上细胞密度变化曲线

在整个培养周期中，葡萄糖浓度维持在1g/L以上，葡萄糖和乳酸浓度变化如图3所示。由每天取样镜检图像（图4）可见，Day3时细胞刚好铺满微载体，此时接毒感染细胞，Day5开始观察到CPE，部分细胞形态变圆，Day6~8呈现明显CPE，最终大部分细胞裂解凋亡并脱落，上清液中可见细胞碎片。

图3 葡萄糖和乳酸浓度变化曲线
图4 每24 h取样镜检图

每天留取7 mL悬液混合后进行TCID₅₀测试，通过Reed-Muench法进行统计分析^[2]，计算TCID₅₀值为7.17×10⁶/mL。取200 μL悬液提取基因组，配置荧光定量体系（SYBR Green / ROX），通过qPCR方法检测CT值为15.06。

结论

在病毒载体制备的工艺开发中，由于不同种类的病毒在感染宿主细胞时通常会表现出对特定细胞株的选择性，并且关键工艺参数（CPP）如温度、DO、pH、细胞密度、MOI、TOI、HOI等都需要进行测试和优化^[3]。迪必尔生物 CloudReady:tm:云平台生物反应器（图5）应用灵活，可实现各类贴壁或悬浮细胞高密度培养，进行批次、补料、灌流等多种生物工艺的开发和优化，助力将QbD理念贯彻到病毒载体制备的工艺开发进程，在基因治疗领域发挥应用潜力。

图5 CloudReady:tm:云平台生物反应器

参考文献

[1] Manservigi R, Argnani R, Marconi P. HSV recombinant vectors for gene therapy[J]. The Open Virology Journal, 2010, 18(4): 123-156

[2] Lei C, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus Infectivity. Virol Sin. 2021, 36(1):141-144.

[3] Sascha Kiesslich, Amine A. Kamen. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances, 2020(44), 107608.

应用技术与工程研究中心(CARE) 张君轩 供稿