迪必尔生物工程(上海)有限公司

图1 辣椒素的生产方法

石河子大学化学化工学院张根林教授团队在ACS Sustainable Chemistry & Engineering上发表了最新的研究成果“Yeast-Based Whole-Cell Factory for the Ecofriendly Synthesis of Vanillylamine as a Critical Step toward Capsaicin Production”。该研究团队在解析香草胺生物合成途径基础上，构建了以苯丙氨酸和酪氨酸为前体的香草胺酵母全合成体系。

研究人员利用酵母异源重组香草胺生物合成途径得到香草胺的产率为6.47 g/L，然后通过上调莽草酸途径来增强苯丙氨酸使香草胺的产量增了11%，进一步的通过重组的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)循环优化甲基转移效率，使香草胺产量提高了84%，最后将酵母菌株从Z2切换到Z6，并重新连接了前体和SAM循环，在1L平行生物反应器(迪必尔生物）上进行了测试，最终香草胺的产量提高到了14.89 g/L（125%），这是目前公开数据中的最高水平。

一、酿酒酵母生产香草胺生物合成途径的建立

为了构建香草胺生产菌株，研究人员设计了两个模块：咖啡酰辅酶A合成模块和香草胺合成模块（图2）

图2 香草胺和辣椒素在工程酵母中的生物合成途径

模块1涉及前体咖啡酰基辅酶A的合成，需要四种酶的催化，包括苯丙氨酸铵裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羟基酰化酶(C4H)、肉桂酰连接酶(4CL)和羟基肉桂酰转移酶(HCT)。

研究人员在含有500 mg/L苯乙醇、0.18mg/L CAPE和49.9 mg/L对香豆酸的YPD培养基中进行摇瓶发酵测试，通过HPLC - MS/MS检测摇瓶发酵结果(图3a)。出乎意料的是，在工程菌株Z1-1中检测到2.94 mg/L阿魏酸(图3a)。而阿魏酸理论上应该由下一步的CAMT产生，这一发现暗示在Z1-1菌株中可能发生了一些未知的反应。

模块2涉及将咖啡酰辅酶A转化为香草胺，并要求表达咖啡酰辅酶A-氧-甲基转移酶(CAMT)、阿魏酰辅酶A水合酶/裂解酶(FerB)和推测的转氨酶(pAMT)。模块2转化过程中需要CAMT、 FerB和pAMT这三种酶。研究人员通过优化得到了Z2菌株，接着在1L平行生物反应器中利用分批补料培养的方式培养96 h后，Z2菌株产生6.47 g/L的香草胺(图4b)，因此在酿酒酵母中首次实现了香草胺的从头生物合成。并在Z2菌株发酵培养液中检测到肉桂酸(86.14 mg/L)和咖啡酸(2.36 mg/L)等中间产物(图3a)，表明两个模块之间协同作用良好。

图3 工程菌株在培养96 小时的中间产物分析

（a）96h时Z1-1和Z2菌株中间产物含量

（b）工程菌株补料批次发酵过程中OD₆₀₀与时间的关系

（c）96h时对工程菌株（Z2、Z3、Z4和Z5）中的酚酸进行定量分析

（d）96h时在所有测试菌株（Y1和Y2）的发酵液中检测原儿茶酸。

（e）香草胺生产的推测途径。

图4 工程酵母合成香草胺

（a）采用高效液相色谱法对香草胺进行了定性分析。

（b）在96h时通过HPLC对香草胺的产生进行定量。

二、另一种香草胺的生物合成途径的发现

研究人员发现在Z2菌株中中间产物较低，为了增加苯丙氨酸和酪氨酸的通量，将TAL、Aro9和PheA引入Z2菌株的δ1位点,构建了Z3菌株。

对Z3菌株进行了发酵测试，测试条件为在初始葡萄糖浓度为2%的YPD培养基中培养后，Z3菌株的香草胺产量为7.16 g/L，比Z2菌株增加了11%(图4b)。但肉桂酸的积累明显减少，Z3的肉桂酸积累量为18.91 mg/L，仅为Z2积累量的21%。

此外，还检测到原儿茶酸、对羟基苯甲酸和香草酸三种新化合物，滴度分别为23.38mg/L、20.51mg/L和5.24 mg/L(图3c)。

经过一系列的研究测试，发现了另一条香草胺的生物合成途径，通过增加苯丙氨酸和酪氨酸的供应增加了香草胺的产量。

咖啡酰辅酶A转化为阿魏酰辅酶A以及原儿茶酸转化为香草酸都需要甲基化，其中SAM充当甲基供体。研究人员采用两种策略通过重构SAM循环来提高甲基转移效率。利用酿酒酵母的SAHase编码基因（SahH）和拟南芥的MAT编码基因（SAM2）共转化到Z2或Z3菌株的rDNA整合位点分别构建了Z4或Z6菌株。此外，将大肠杆菌的Mtn和LuxS与SAM2共转化到Z2或Z3菌株，分别产生了Z5或Z7菌株。

接着研究人员将得到的Z4、Z5、Z6和Z7菌株在1L平行生物反应器中进行了发酵测试，发酵条件为：温度30°C，初始葡萄糖为20g/L，发酵24小时后每12小时进行一次补料操作，直到96小时发酵结束。在发酵过程中使用氢氧化钠/硫酸控制pH保持在7.0。结果显示，Z4和Z5菌株的香草胺滴度分别为9.21和11.88 g/L（图4b），与工程Z2菌株相比，滴度分别提高了42%和84%。此外，在Z6和Z7菌株中分别检测到14.89g/L和14.07g/L的香草胺，与Z2菌株相比增加了125%。

这些结果表明，这两种策略都有效地改善了SAM作为甲基转移反应的甲基供体的积累，从而促进了代谢途径的平衡。

此外，他们也发现了与野生型酵母（CK）相比，所有工程菌株的生物量都有所减少（图3b）。在发酵96小时后，Z4、Z5、Z6和Z7的生物量分别下降了25%、13%、10%和18%，积累的醋酸盐分别达到了2.28g/L、3.03g/L、2.06g/L和2.95g/L。因此，可能的原因为香草胺和醋酸会抑制菌株的生长与活力。

在辣椒素合成酶(CS)的催化下，香草胺能与8-甲基-6-壬烯酰辅酶A酯化反应生成辣椒素。在此基础上，研究人员设计了模块3，并在初始Z2菌株上构建了C1菌株，在1L的平行反应器上做了相应的发酵测试，采用补料批次培养策略，发酵初始培养基葡萄糖浓度为20g/L,培养120h,辣椒素的产量为80.23μg/L（图5）,因此实现了辣椒素在酿酒酵母细胞上的重头合成。此外，在C1菌株中还检测到142.46 g/L的8-甲基-6-壬烯酰辅酶A和6.02 g/L的香草胺。8-甲基-6-壬烯酰辅酶A供应过慢可能会限制辣椒素的生产。

因此，增加8-甲基-6-壬烯基酰辅酶A的积累将是酵母生产辣椒素的潜在有益途径。

图5 工程酵母合成辣椒素

(a) 采用HPLC - MS/MS对辣椒素标准品进行定性分析

(b) 采用HPLC - MS/MS对样品进行定性分析

参考文献 

 Zhao, J. , Li, Y. , Yi, L. , Zhang, G. , & Ye, B. . (2023). Yeast-based whole-cell factory for the ecofriendly synthesis of vanillylamine as a critical step toward capsaicin production. ACS Sustainable Chemistry & Engineering.

图6 Minibox 5  第5代平行生物反应器

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图7  CloudReady :tm:️云生物反应器

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